Биотехнологическое производство спиртовых дрожжей

МИНОБРНАУКИ РОССИИ ФГБОУ ВО «Тульский государственный университет» Кафедра биотехнологии (наименование выпускающей кафедры) ДИПЛОМНАЯ РАБОТА Направление 19.03.01 Биотехнология Тема: Биотехнологическое производство спиртовых дрожжей Студент группы № _____________ ФИО (подпись, дата) (фамилия, инициалы) Руководитель работы _____________ регалии, ФИО (подпись, дата) (фамилия, инициалы) Заведующий кафедрой ______________ Понаморева О.Н. (подпись, дата) (фамилия, инициалы) Тула, 2023 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ 3 ГЛАВА 1. ХАРАКТЕРИСТИКА СПИРТОВЫХ ДРОЖЖЕЙ 6 1.1. Спиртовые дрожжи 7 1.2. Saccharomyces cerevisiae 8 1.3. Спиртовые штаммы Saccharomyces cerevisiae 13 1.3.1. Штамм Saccharomyces cerevisiae 1039 (ВКПМ Y-3327) 14 1.3.2. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-4281 15 ГЛАВА 2. ХАРАКТЕРИСТИКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА 16 2.1. Условия для нормальной жизнедеятельности дрожжей 17 2.2. Выращивание чистой культуры 17 2.2.1. Получение чистой культуры 18 2.2.2. Выращивание чистой культуры на производстве 19 2.3. Выделение дрожжей из бражки 23 2.3.1. Флотация 23 2.3.2. Сепарация 25 2.3. Сушка дрожжей 28 ГЛАВА 3. КОНТРОЛЬ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ГОТОВОГО ПРОДУКТА 32 ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОБОЧНЫХ ПРОДУКТОВ, УТИЛИЗАЦИЯ ОТХОДОВ 35 ГЛАВА 5. РАСЧЕТНОЕ ЗАДАНИЕ 36 ВЫВОДЫ 46 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 48  ВВЕДЕНИЕ Спиртовая промышленность - отрасль пищевой промышленности, производящая сырой этиловый спирт и ректификованный спирт из пищевого сырья (зерно, картофель, патока). Спирт направлен на нужды пищевой промышленности, медицины и радиоэлектроники. Производство алкоголя имеет давнюю историю, так, например, винный спирт впервые был получен в Италии в XI веке в результате перегонки виноградного вина. В Российской Федерации производство винного спирта начало свою историю примерно в XII веке. В будущем производство алкоголя стало очень важным источником государственных доходов [1]. Спиртовая промышленность тесно связано с одной стороны с большим количеством отраслей народного хозяйства, для многих из которых этиловый спирт является основным сырьем, либо вспомогательным материалом, а с другой стороны – непосредственно с сельским хозяйством. То есть, спиртовая промышленность получает от сельского хозяйства разнообразное растительное сырье (зерно различных злаковых культур, картофель и прочее), извлекает из него и из мелассы углеводы, а возвращает востребованные витаминизированные белковые корма. Эта отрасль промышленности является единственной способной перерабатывать дефектное (порченое) зерно и картофель в доброкачественные продукты [2]. Способность дрожжей сбраживать сахар в спирт представляет собой важнейший биотехнологический процесс в мире. Этиловый спирт (этанол), является ведущим глобальным продуктом биотехнологии как в объемном, так и в экономическом отношении. Установлено, что активное участие в спиртовом брожении принимают дрожжи, в частности Saccharomyces cerevisiae. Этот вид можно рассматривать как выдающийся промышленный микроорганизм. Помимо своей роли в производстве напитков и биоэтанола, S. cerevisiae отвечает за производство многих других продуктам, получаемым в процессе ферментации, например, хлебобулочные изделия, ароматизаторы и красители, агенты биоконтроля, ферменты, пробиотики, химические товары, терапевтические белки и биофармацевтические препараты. Таким образом, статус S. cerevisiae как главного микроорганизма в промышленности не имеет себе равных [3]. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae представляют собой факультативных анаэробов, по типу питания – хемоорганогетеротрофы, а по отношению к активной кислотности среды – ацидофилы. К применяемым в спиртовой промышленности, при переработке крахмалистого сырья, микроорганизмам предъявляется ряд требований, а именно, они должны иметь высокую бродильную активность, характеризоваться полной сбраживаемостью сахаров, а также устойчивостью к продуктам метаболизма, особенно к этиловому спирту, и развитию посторонней микрофлоры [4]. К настоящему моменту, благодаря усилиям микробиологов и генетиков, создано множество рас спиртовых дрожжей, среди которых Р XII, V 717 VI986 и других, которые отличаются лучшими свойствами друг от друга. Многообразие существующих вариантов обусловлено стремлением ученых получить новые расы дрожжей, обладающих наилучшими свойствами, например, повышенной или высокой бродильной активностью, обладающих амилолитической и протеолитической способностью, способных сбраживать сусло наиболее полно, в широком диапазоне температур и в кратчайшие сроки [2]. Целью настоящей дипломной работы являлось изучение процесса биотехнологического производства спиртовых дрожжей. На основании поставленной цели были сформулированы следующие задачи: 1.Охарактеризовать группу спиртовых дрожжей, описать вид Saccharomyces cerevisiae, который взят за основу создания многих рас спиртовых дрожжей и описать некоторые из коммерческих штаммов; 2.Изучить и описать биотехнологический процесс получения спиртовых дрожжей; 3.Представить основные контролирующие и стандартизирующие спиртовые дрожжи документы; 4.Охарактеризовать побочные продукты биотехнологического производства спиртовых дрожжей и описать основные пути их утилизации; 5.Выполнить расчетное задание.  ГЛАВА 1. ХАРАКТЕРИСТИКА СПИРТОВЫХ ДРОЖЖЕЙ Накапливание этилового спирта в среде в анаэробных условиях характерно для разных групп эубактерий и эукариотических микроорганизмов, а именно дрожжей. Спиртовое брожение – это процесс преобразования углеводов, углеводсодержащих отходов, вызываемый дрожжами, некоторыми видами бактерий и различными представителями мукоровых грибов, с выходом целевого продукта в виде этанола. Возбудителями спиртового брожения являются некоторые виды дрожжей (Saccharomyces cerevisiae, S. uvarum, Schizosaccharomyces pombe и др.) и бактерий (Erwinia amylovora, Sarcina ventriculi, Zymomonas mobilis). Кроме того, этиловый спирт образуют мезофильные бактерии (Leuconostoc mesenteroides, Lactococcus lactis, Clostridium sporogenes, Spirochaeta aurantia), а также термофильные бактерии (Thermoanaerobacter ethanolicus, Clostridium thermohydrosulfuricum, C. thermocellum). Сбраживание глюкозы проходит по гликолитическому пути до стадии синтеза пировиноградной кислоты. Затем осуществляется ее декарбоксилирование пируватдекарбоксилазой при участии тиаминпирофосфата, в результате чего образуются ацетальдегид и СО2. Ацетальдегид выступает конечным акцептором водорода. При помощи алкогольдегидрогеназы он восстанавливается до этанола [9]. Общая схема спиртового брожения представлена на рисунке 1. Рисунок 1 – Схема спиртового брожения [URL: https://studme.org/htm/img/32/3357/84.png] 1.1.Спиртовые дрожжи Saccharomyces cerevisiae, несомненно, является основным микроорганизмом, продуцирующим этанол, и относится к так называемым спиртовым дрожжам, но это не единственный вид дрожжей, способный к спиртовому брожению. В настоящее время, описано огромное количество видов дрожжей, около 1500 охарактеризованных видов, которые могут быть использованы как в производстве напитков, в том числе алкогольных, так и в производстве биотоплива. Некоторые дрожжи, не относящиеся к Saccharomyces, уже нашли свою нижу в процессах биотехнологической ферментации, так, например, Kluyveromyces marxianus может ферментировать лактозу, что не свойственно для S. Cerevisiae, и используется при ферментации сырной сыворотки для производства спиртных напитков [5]. K. marxianus также активно используется в ферментации для производства традиционных мексиканских спиртных напитков — текилы и мескаля с использованием сырья из голубой агавы (Agave tequilana), а также, возможно, биоэтанола из полифруктановых субстратов [6]. В пивоварении и виноделии применяются другие «нетрадиционные дрожжи» для придания пиву и вину желаемого вкуса и аромата, так, например, было доказано, что штаммы видов Candida, Pichia и Wickerhamomyces усиливают вкус пива. В частности, W. anomalus при совместном использовании с лагерными пивоваренными дрожжами усиливал фруктовый вкус пива [7]. В ходе экспериментальной работы было установлено, что Lachancea thermotolerans способны продуцировать молочную кислоту и этот вид потенциально может быть использован при ферментации солодового сусла при производстве кислого пива [8]. Несмотря на то, что преимущества большинства дрожжей, не относящихся к классу Saccharomyces, при спиртовом брожении заключаются больше в их способности придавать напиткам интересные вкусовые качества, а не в повышении выхода этанола, некоторые дикие дрожжи являются перспективными в качестве «спиртовых дрожжей». Например, Dekkera bruxellensis была выделена на пшеничных заводах в Швеции, где она образует «альянс» с молочнокислыми бактериями в микробиологическом консорциуме, производящем этанол, который может доминировать в заквасочных культурах S. cerevisiae. Аналогичным образом, дикие штаммы Saccharomyces были обнаружены в качестве преобладающих дрожжей на бразильских заводах по производству топливного этанола, использующих патоку сахарного тростника в качестве субстрата для ферментации [3]. 1.2.Saccharomyces cerevisiae Несмотря на большое разнообразие дрожжей и других микроорганизмов, имеющих потенциал в спиртовой промышленности, родоначальником большинства штаммов производственных спиртовых дрожжей являются Saccharomyces cerevisiae. В настоящее время годовое производство спирта в мире составляет более 100 млрд литров, при этом Saccharomyces cerevisiae является преимущественно используемым промышленным микроорганизмом для производства этанола. Таким образом, можно говорить о том, что дрожжи S. cerevisiae являются предпочтительным микроорганизмом для промышленного производства этанола и, как таковые, представляют собой крупнейшее промышленное биотехнологическое использование дрожжей [11]. По принятой на данный момент систематике и генетическим исследованиям, дрожжи Saccharomyces cerevisiae относятся к царству грибов – Mycota, к отделу – Eumycota, к классу – Ascomycetes, семейству – Saccharomycetaceae, к роду – Saccharomyces, виду – cerevisiae [13]. В современной классификации вид S. cerevisiae объединяет как культурные, так и дикие штаммы. Большинство известных штаммов S. cerevisiae изолировано из различных бродильных процессов. Культурные штаммы S. cerevisiae очень полиморфны по ферментационным спектрам. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae (рисунок 2) являются эукариотическими микроорганизмами, генетически более сложными, нежели бактерии. Клетка дрожжей, по сравнению с клеткой Escherichia coli, содержит в 3,5 раза больше ДНК. Вместе с тем, в качестве экспериментального объекта дрожжи обладают многими из технических преимуществ, обеспечивших быстрый прогресс молекулярной генетики прокариот и их вирусов [12]. Рисунок 2 - Saccharomyces cerevisiae, фазово-контрастная микроскопия (100х) [URL: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/4/42/Saccharomyces_cerevisiae_100x_phase-contrast_microscopy.jpg] Клетки S. сеrevisiae имеют округлую, яйцевидную или эллипсоидную форму; размер их колеблется от 2,5 до 10 мкм в поперечнике и от 4,5 до 21 мкм в длину. Размер и форма клеток одного и того же штамма определяются генетически и могут варьироваться в определенных пределах в зависимости от условий культивирования и последующих операций получения коммерческих дрожжей (обезвоживание). Клетки дрожжей состоят из микроскопических и субмикроскопических, видимых только в электронном микроскопе, структур, и эти структуры можно подразделить на постоянно присутствующие и периодически обнаруживаемые в клетке. К первым относятся органеллы, а именно ядро с ядрышком, митохондрии, рибосомы, клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана, эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, лизосомы, хитосомы, гликосомы и целый ряд других мембранных структур. Все клеточные органеллы окружены мембранами. В состав мембран входит большое количество фосфолипидов, причем их содержание как в количественном, так и в качественном составе определяется природой органеллы. К группе непостоянных структур относятся различные включения, которые то возникают, то исчезают в процессе жизнедеятельности клеток. Этими непостоянными структурами являются внутриклеточные запасные соединения: жиры, гликоген и полифосфаты. Включения могут быть представлены в виде более или менее плотных частиц – гранул, кристаллов или капель. Клеточная стенка является частью клеточной оболочки, в состав которой входит также периплазматическое пространство. Клеточная стенка представляет собой слоистую структуру толщиной около 25 нм и состоящую из 3-х слоев: 1-й (наружный) слой – это тонкая липопротеиновая мембрана; 2-й слой – значительно более толстый слой – представляет собой маннано-протеиновый комплекс; 3-й слой состоит из глюкана, он имеет слоистую структуру. На долю клеточной стенки приходится от 6 до 25 % сухой массы клетки. Химический анализ клеточной стенки показывает, что она состоит в основном из глюкана и маннана; наряду с этими компонентами в стенке присутствуют хитин и белок [15]. Геном почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae был первым полностью секвенированным у эукариот. Saccharomyces cerevisiae обладает ядерной геномной ДНК длиной 12068 килобаз (т.п.н.), организованной в 16 хромосомах. Его геном был полностью секвенирован Goffeau et al. 1996 и было установлено, что геном содержит около 6000 генов, из которых, по прогнозам, 5570 являются белок-кодирующими генами. Биоинформатический анализ показал, что ряд генов, кодирующих белки, имеют чужеродное происхождение, то есть являются результатом латерального переноса генов. Эти гены, вошедшие в геном S. cerevisiae путем горизонтального переноса, имеют либо прокариотическое, либо эукариотическое происхождение. Hall с коллегами в 2005 году [16] обнаружили 10 генов предположительно прокариотического происхождения, присутствующих в геноме S. cerevisiae. Одним из примеров приобретения гена от другого эукариота является ген FSY1, кодирующий переносчик фруктозы и, вероятно, произошел от какого-то близкого родственника S. cerevisiae. Этот ген считается важным, поскольку его продукт, вероятно, придает штамму-хозяину (EC 1118) повышенную способность использовать фруктозу в условиях низких концентраций гексозы, присутствующих в сусле (то есть ближе к конечной фазе ферментации) [17]. Алкогольная ферментация дрожжами Saccharomyces мальтозы, сахарозы и мелибиозы контролируется, соответственно, полимерными генами MAL, SUC и MEL, которые расположены в теломерных областях различных хромосом и могут накапливаться в определенных штаммах Saccharomyces cerevisiae имеет ограниченную толерантность к этанолу, и максимальная концентрация, при которой возможен рост, составляет 10% (p:v), а высокие концентрации этанола могут влиять на структуру ферментов, что приводит к снижению каталитической активности. Saccharomyces cerevisiae мезофильны и растут они при температуре от 25°С до 30°С, и известно, что температура влияет на интенсивность роста и на обменные процессы в клетке. Уменьшение температуры от оптимума уменьшает общий выход дрожжевой массы, незначительное повышение температуры резко тормозит скорость роста дрожжей. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae обладают многими полезными промышленными свойствами, такими как быстрый рост, эффективный анаэробный метаболизм глюкозы, высокая производительность по этанолу, большой выход и высокая устойчивость к различным стрессовым факторам окружающей среды, таким как высокая концентрация этанола, низкий pH и низкий уровень кислорода. Т.е. использование существующих или адаптированных штаммов промышленных дрожжей в биотехнологических и промышленных ферментациях носит интенсивный характер; тем не менее, есть еще много возможностей для улучшения, поскольку современные промышленные процессы редко используют новые природные штаммы [11]. Дрожжи представляют собой физиологически очень разнообразную группу микроорганизмов, но в настоящее время S. cerevisiae доминирует в биотехнологическом использовании, особенно в производстве алкоголя. S. cerevisiae как представители спиртовых дрожжей, обладают многими полезными характеристиками, но также для них свойственны некоторые недостатки, которые представлены в таблице 1. Таблица 1. Преимущества и недостатки Saccharomyces cerevisiae по сравнению с другими, потенциальными, спиртовыми дрожжами Преимущества Недостатки Хорошо подходят для процессов промышленной ферментации Не способны ферментировать некоторые сахара, например, ксилозу, арабинозу, лактозу, мальтодекстрины Возможны высокие скорость ферментации и выход этанола (>20% по объему) Накапливают «стрессовые» углеводы, такие как гликоген, трегалозу, а также могут накапливать глицерин Отличаются относительной стрессоустойчивостью Для них характерен Эффект Кребтри (репрессия глюкозой) Хорошо изучен геном и легко поддаются генетическим модификациям для создания более подходящих штаммов Для микроорганизма характерен рост в не строго анаэробных условиях Рассматривается как безопасный (GRAS) микроорганизм Характерная переменная флокуляция (агрегация дрожжевых клеток) Дают широкий спектр вкусовых характеристик напиткам Возникновение спонтанных мутаций Несмотря на присущие Saccharomyces cerevisiae недостатки, данные дрожжи являются основой для большого количества спиртовых дрожжей, применяемых в крупномасштабном производстве этанола. 1.3.Спиртовые штаммы Saccharomyces cerevisiae К спиртовым расам дрожжей предъявляются достаточно жесткие требования: они должны обладать высокой бродильной активностью; быстро и полностью сбраживать сахара, а также использовать другие компоненты питательной среды в анаэробных условиях, быть устойчивыми к продуктам собственного обмена (особенно к этанолу), хорошо противостоять развитию инфекций. Кроме того, они должны обладать способностью переносить высокие концентрации сухих веществ, и, по возможности, сбраживать разные виды углеводов, в том числе рафинозу, галактозу и декстрины. В последние годы ведутся активные работы в области биотехнологии, направленные на селекцию рас дрожжей с заданными производственными характеристиками. Исключительный интерес биотехнолог�